Cet article fait 8 pages. En voici le plan :.
Partie 1 : RÉSUMÉ ET INTRODUCTION ,
Partie 2 : (ici) LA PARTIE MATÉRIEL ET MÉTHODES,
Partie 3 : RÉSULTATS,
Partie 4 : Discussion,
Partie 5 : mon résumé personnel en termes simplifiés
Matériel et méthodes
Echantillons
24 BW avec pedigree du Canada, USA, France et Allemagne ont été étudiés ainsi qu’un braque de Weimar ‘grs’ descendant d’un ‘bleu x bleu’ issu des US. La plupart des chiens étudiés sont étroitement liés à deux pédigrés larges ; 6 autres BW non apparentés et non liés à ces pédigrés ont été inclus dans cette étude. Tous les chiens bleus étaient de variété poil court. En complément, 20 braques gris originaires d’Allemagne, avec leur pedigré, ont été examinés, des variétés poil court et poil long. D’autres chiens de races différentes (4 bergers australiens, un curly coated retriever, deux teckels, un cocker spaniel, un springer spaniel, un caniche, trois pinschers, 3 grands Munsterlanders et 3 Löwchen) avec une couleur noire (partielle) de robe ont été sélectivement caractérisés. Des prélèvements bucaux et des échantillons de sang ont été reçus comme autorisé par les propriétaires de ces chiens. L’ADN a été isolé selon les protocoles stantards (Miller et al. 1988) ou avec le miniKit ADN QIAmp (Qiagen, Hilden, Allemagne) en suivant le protocole du fabriquant. Après l’extraction ADN, la concentration d’ADN a été mesurée en utilisant un spectromètre NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Inc, Rockland, DE, USA).
Protocole PCR standard et analyse de séquence
Pour l’analyse des gènes candidats, nous avons surveillé les variations connues de 4 gènes : CBD103, MC1R, MLPH et TYRP1 (pour les désignations des allèles et génotypes, voir Schmutz et al. 2002 et Candille et al. 2007). Le typage a été effectué en suivant les protocoles de réaction en chaîne polymerase santards (PCR). Les PCR ont été exécutés dans un thermocycleur (Biometra, Göttinger, Allemagne). 10 µlde mélande d’amplification PCR contenant 50ng d’ADN dans 100mM Tris (ph 8.3), 1 U Tag polymerase (Genedraft, Münster, Allemagne), 0,2 mM de chaque dNTP, 0,7 nM de chaque primaire (table S1) et 1.5-2 mM de MgCl2 dans 500mM KCl ont été exécutés sur des plaques de microtitration à 96 puits (Thermowell Costar, Corning, NY, USA). Alternativement, un mastermix (Hotstar Mastermix, Qiagen) a été utilisé, les PCRs ont été exécutés sour les conditions PCR standard (Dekomien & Epplen 2002) avec les températures de recuit indiquées dans la Table 1A et 30 cycles dans le thermocycle. Différentes méthodes d’analyses basées sur le PCR ont été appliquées pour génotyper les gènes sus mentionnés. Les produits des PCR ont été résolus et visualisés des des gels à 2-3% d’aragose traités de bromide d’ethidium. Dans le but de controler les résultats du génotype, plusieurs produits de PCR choisis aléatoirement ont été séquencés de manière exemplaire. Les réactions de séquençage ont été effectuées par le procédé de terminaison de chaîne dideoxy en utilisant le kit Dyenamic ET Terminator (GE Heathcare, Munich, Allemagne) selon les instructions du fabriquant. Les séquences ont été jouées sur un séquenceur d’ADN capillaire automatisé (MegaBACE 1000, GE Healthcare, Allemagne). Les séquences ont été éditées, assemblées et alignées en utilisant l programme SEQMAN (DNAstar, Madison, WI, USA).
génotypage du MC1R p.R306X (allele E)
Le « PCR d’amorce à queue » ‘Jagiello et al. 2004) a été utilisé pour tracer le CBD103 dans le but de résoudre la différence 3–bp entre le type sauvage (allèle ky) et le génotype ΔG23 (allèle KB) (Candille et al. 2007), qui ne peut pas être résolu sur les gels d’agarose. Cette méthode nécessite trois oligonucléotides pour l’amplification : un apprêt avant à queue (tailed F), un apprêt inversé et un apprêt marqué par fluorescence (marqué F) correspondant à la 5ème séquence de queue de F. Les conditions de PCR ont été les mêmes que décrites dans le protocole PCR standard, excepté pour les concentrations d’apprêt qui furent comme suivant : 0,2pmol de tailed F; 2,5pmol marqué F et 2.5 pmol d’apprêt inversé. Les PCR pour l’amplification microsatellite ont aussé été réalisées sous les conditions PCR standards (Dekomien & Epplen 2002) de 57°C de température de recuit et 30 cycles dans un terhmocycleur. Les produits PCR ont été résolus sur un Beckmann CEQ8000 et dimensionnés et notés avec le logiciel d’analyse respective.
Génotypage du gène CBD103, p.23delG (ΔG23, allèle KB)
(Reste à traduire)
Génotypage du gène MLPH c.106C≥T (allele d
(Reste à traduire)
Génotypage du gène TYRP1 exon 5 p.Q331X (allele bs)
(Reste à traduire)
Génotypage du gène TYRP1 exon 5 p.345delP (allele bd)
(Reste à traduire)
Typage de microsatellites au locus TYRP1
(Reste à traduire)
Haplotypage du chromosomeY
(Reste à traduire)
Haplotype et analyse statistique
(Reste à traduire)
